HE 与多重免疫荧光配准，是建立 HE 组织形态与 MIF 蛋白表型之间的空间对应关系。 当研究需要把 HE 上圈出的肿瘤区域对应到荧光图像，或分别统计肿瘤、间质中的免疫细胞时，配准能够为区域判断与定量提供共同的位置依据。
HE（H&E）呈现组织形态，多重免疫荧光（MIF，文献中也常写作 mIF）提供所选标记物的表达信息。两者结合，可以围绕“什么细胞、位于哪里、在多大范围内比较”开展研究。是否需要配准，应由具体分析目标和样本关系决定。
1 HE 与多重免疫荧光分别提供什么信息
HE（H&E，苏木精—伊红染色）呈现细胞形态和组织结构。结合形态学判断，可以识别肿瘤区域、间质、腺体、血管，以及坏死等组织改变。
多重免疫荧光（MIF，学术文献中也常写作 mIF）则通过预先选择的标记物组合，检测目标蛋白及其表达组合，帮助区分细胞类型与状态。它能够提供哪些信息，与标记物组合、染色质量和分析条件有关。
Lin 等发表于《Nature Cancer》的研究展示了这种互补性：一些在 HE 中形态相近的淋巴细胞，可以通过荧光标记区分；而研究所用标记物组合未覆盖的部分细胞，以及黏液池、坏死等结构，在 HE 中更容易辨认。1｜形态与荧光信息互补的研究，图 3 及对应正文
图 1｜同片荧光、HE 与叠加对照。节选自 Lin 等，2023，Fig. 3a。
因此，在解释一块荧光信号较弱或细胞分类不清的区域时，HE 可以提供额外的形态线索。局部“没有检测到某类标记”，需要结合那里的组织结构和检测范围来理解。
2 HE 与 MIF 叠图为什么需要确认空间对应
把两张图并排放置，可以观察整体差异；要将 HE 上的区域判断用于荧光定量，还需要知道两张图中的位置怎样对应。
不同染色和扫描过程可能带来位移、旋转、尺度及组织形变。图像配准，就是建立不同图像之间的空间对应关系。 对 HE 与 MIF 而言，它使我们有依据地判断：HE 上圈出的这块肿瘤区域，在荧光图像中对应哪里。
研究者常把这种需求称为“HE 和免疫荧光叠图”“明场与荧光图像叠加”。其中，merge 通常描述通道合并，overlay 描述叠加显示；叠加后的组织是否对齐，仍需要核查。准确的位置对应，才是后续联合分析的基础。
3 哪些具体需求适合进行 HE 与 MIF 配准
当研究问题同时涉及“细胞表达什么”和“细胞位于什么组织区域”时，就适合评估 HE 与 MIF 配准。例如，你可能正在解决下面这些具体问题。
| 具体分析需求 | 常见研究场景 | 配准的作用 |
|---|---|---|
| 把 HE 上圈出的肿瘤区域对应到 MIF | 病理标注迁移、感兴趣区域（ROI）映射 | 将 HE 上的肿瘤、间质等区域映射至荧光图像，核查边界后开展 ROI 分区定量。 |
| 分别统计肿瘤与间质中的 CD8 阳性细胞密度 | 肿瘤免疫微环境、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）研究 | 将细胞表型与组织分区对应，明确各区域的细胞数量和面积，保留免疫浸润位置差异。 |
| 测量免疫细胞到肿瘤边界的距离 | 细胞空间分布、空间生物标志物研究 | 结合经核查的肿瘤边界和细胞坐标，比较边界内外或不同距离范围的细胞分布。 |
| 核对 HE 可见而 MIF 中分类不清的细胞 | 细胞表型复核、形态与蛋白表达联合分析 | 回到同一位置观察细胞形态，检查标记物覆盖与分类结果；形态线索不能替代缺失的分子检测证据。 |
| 排除坏死或缺损后统计有效组织面积 | 病理分区、细胞密度和队列比较 | 将 HE 辅助识别的排除区域与荧光图像对应，在一致的有效区域内计算面积和细胞密度。 |
| 比较不同处理组或治疗前后的免疫浸润变化 | 组织药效评价、转化研究、预后队列研究 | 在各自样本内对应 HE 与 MIF，再用统一分区和排除规则比较细胞表型及空间特征。 |
不同处理组或治疗前后的比较，应先在各自样本内建立 HE 与 MIF 对应，再按统一规则比较，不能将不同时间点的细胞视为一一对应。
对于表中的细胞表型复核，原研究提供了一个直观例子：所用标记物组合未特异识别的部分细胞，可以结合 HE 形态补充辨认。
图 2｜HE 补充观察细胞类型与有丝分裂形态。节选自 Lin 等，2023，Fig. 3b。
4 CD8 阳性细胞是在肿瘤内部还是周围间质
肿瘤免疫微环境研究关心细胞的数量，也关心细胞所在的组织区域。
一张切片中，免疫细胞可能进入肿瘤实质，也可能主要分布于间质或肿瘤边缘。只统计整张切片的阳性细胞总数，会将这些空间差异合并到一个数值中。
Galon 等在结直肠癌队列中研究了免疫细胞的类型、密度和位置与患者生存的关系，结果表明，将这些信息结合具有预后研究价值。这也说明，细胞“出现在哪里”本身就是值得保留的研究信息。2｜免疫细胞类型、密度与位置的原始研究
HE 与多重免疫荧光配准后，可以将经病理判断的组织区域与细胞表型对应起来，分别观察：
- 肿瘤实质内有哪些免疫细胞，密度如何；
- 周围间质中的免疫细胞是否呈现不同的分布；
- 肿瘤边界附近是否存在细胞聚集，以及分布是否随位置改变。
这让“免疫细胞多不多”的问题，进一步落实到具体的组织区域。
图 3｜免疫细胞在肿瘤实质内或周围间质中的分布。AI 辅助示意图，非实验数据。
5 让细胞密度和区域比较有明确的统计范围
分区分析需要明确细胞属于哪个区域，以及用多大的组织面积作分母。
例如，假设两个区域都检测到 100 个目标细胞，一个区域面积为 0.5 mm²，另一个为 2 mm²，那么细胞密度分别为 200 个/mm² 和 50 个/mm²。这是一个计算示例，说明相同的细胞数量可以对应不同的密度。
在真实样本中，还需要确定空白、折叠、坏死或缺损区域是否纳入，以及每个区域采用什么统计规则。HE 可以辅助界定组织边界和需要排除的结构；配准则让这些区域能够与荧光图像对应。完成映射后，仍需检查边界并修正局部误差。
区域边界和面积口径一致，细胞密度的比较才有清楚的含义。 如果区域映射发生偏移，细胞可能被分到错误的组织区域，后续统计也会受到影响。
6 免疫细胞到肿瘤边界的距离怎样解释
在多重免疫荧光图像分析中，我们还会观察细胞之间的距离、邻近关系和局部聚集。
如果要测量免疫细胞到肿瘤边界的距离，需要先将肿瘤边界与细胞所在位置对应起来。边界来自 HE 时，局部配准误差可能影响细胞被归入边界内、边界外或某个距离范围，因此应按目标距离尺度核查对应质量。
这些结果结合 HE 的组织结构，更容易解释：一群免疫细胞的聚集发生在肿瘤边缘、血管周围，还是某种淋巴样结构附近？两个样本出现相似的细胞密度，是否对应相同的组织环境？
HE 与 MIF 的对应关系，为这些问题提供了可共同核对的图像依据。病理研究者可以从组织形态出发，分析人员可以从标记物和细胞分布出发，在同一位置讨论结果。
例如，Lin 等将标记阴性细胞较多的区域与同片 HE 对照，结合组织形态核查了肌肉、间质等组织背景。这样的对照有助于解释局部未分类细胞所处的组织环境。1｜信息互补章节及图 3e
图 4｜标记阴性细胞所在区域的荧光与 HE 对照。节选自 Lin 等，2023，Fig. 3e。
需要注意，空间邻近可以支持进一步提出研究问题；仅凭图像中的距离，还不能确定细胞之间存在功能性相互作用。
7 相邻切片对齐后能否逐个细胞比较
同一张切片经过合理设计的染色和成像流程，有机会将同一批细胞的形态与分子信息对应起来。Lin 等的研究采用了同片荧光与 HE 联合成像，展示了这一思路。1｜同片形态与荧光联合分析研究
相邻切片配准、连续切片对齐则需要考虑切面差异：有些细胞只出现在其中一张切片，局部结构也可能发生变化。因此，相邻切片通常更适合先讨论经过核查的区域对应；单细胞身份和共表达关系，需要额外证据。
分析目标也决定了需要核查多细的对应关系。比较大片组织区域，与判断细胞是否跨过肿瘤边界，对局部误差的要求不同。整体轮廓重合，不能单独证明局部已经满足分析需要。
当研究需要将蛋白表型与病理形态、组织分区和细胞空间分布结合时，HE 与多重免疫荧光配准就具有明确的价值：让我们能够说明，什么样的细胞，出现在什么组织结构中，并在怎样的范围内进行比较。
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8 HE 与 MIF 配准的常见问题
HE 与 MIF 叠图和荧光 merge 是同一件事吗
不是。merge 通常描述通道合并，overlay 描述叠加显示；图像配准建立图像之间的空间对应。图层能够叠加显示，并不能单独证明组织边界和细胞位置已经满足联合分析的要求。
HE 上的肿瘤标注能直接复制到 MIF 图像吗
需要先核对两张图像的坐标和局部组织结构。不同染色或扫描过程可能产生位置、方向、尺度或形变差异。将 HE 标注用于 MIF 分区统计前，应检查映射后的边界与有效组织范围。
HE 与 MIF 配准后怎样比较 CD8 阳性细胞密度
应分别明确肿瘤、间质等分析区域，记录各区域纳入的目标细胞数和有效组织面积，再按统一规则计算细胞数除以面积。比较不同样本时，区域定义、排除规则和细胞表型判定需要保持可比。
HE 能补出 MIF 没有检测的标记物吗
不能。HE 可以提供细胞与组织的形态线索，帮助复核未分类细胞和局部组织背景，但不能补出未检测的分子标记，也不能单独证明缺失标记物的表达或共表达。
9 参考文献与图片来源
- Lin JR, Chen YA, Campton D, et al. High-plex immunofluorescence imaging and traditional histology of the same tissue section for discovering image-based biomarkers. Nature Cancer. 2023;4(7):1036–1052. DOI：10.1038/s43018-023-00576-1。开放全文。文中图 1、图 2、图 4 分别节选自原文 Fig. 3a、3b、3e，© The Author(s) 2023，按 CC BY 4.0使用；保留原有标记与比例尺。
- Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 2006;313(5795):1960–1964. DOI：10.1126/science.1129139。PubMed 摘要。
图 3 为 AI 辅助绘制的原理示意，非实验数据。